反應杯靜電導致的背景異常升高

在某些情況下，廠家生產、運輸及保存的反應杯，會有概率發生靜電積累的現象。大多數廠家的吖啶酯檢測系統，在讀數模塊工作前，會先在反應杯中注入激發液B（通常是特定濃度的氫氧化鈉溶液），然后讀數模塊立刻進行讀數操作。在這個激發液的注入過程中，可能會使反應杯中積累的靜電釋放，并被光電倍增管捕捉到，從而導致背景異常升高。（德晟資料）

吖啶酯的污染導致的背景異常升高

此情況多發生在研發階段，通常采購的吖啶酯是粉末狀態，在配制吖啶酯稀釋液的過程中，會有少量的吖啶酯消散在環境中，成為了實驗室氣溶膠的一部分，如果吖啶酯氣溶膠含量達到一定程度，會污染敞口放置的反應杯，或是敞口放置的洗滌液桶。吖啶酯在只有1 pmol/L的濃度下，依然有很高的發光值，遠高于背景值。所以研發過程中，吖啶酯引起的污染也需要重視。

03  未經過優化的吖啶酯偶聯工藝，

               導致背景異常升高

目前市場上在售的吖啶酯，都是經過琥珀酰亞胺酯（–NHS ester）修飾的，它的存在使得吖啶酯可以直接和伯胺（–NH2）反應，形成穩定的酰胺鍵。伯胺普遍存在于多肽鏈的 N-端和賴氨酸氨基酸殘基的側鏈中。所以修飾過的吖啶酯很容易在水性介質中與蛋白質（例如抗體）發生反應。通常吖啶酯偶聯工藝，投料的吖啶酯摩爾量是超過抗體的，這些過量的吖啶酯需要進行終止，此時可添加Tris、甘氨酸或賴氨酸緩沖液以淬滅反應。未經過充分淬滅的吖啶酯抗體偶聯物，可能會導致背景的異常升高。

有條件的話，可以在偶聯工藝最后中加入一步純化操作，G50和G25脫鹽柱都是很好的選擇。有些抗體在與吖啶酯偶聯后，會發生少量的聚集現象，形成超過抗體本身大小的聚集形態，在溶液中無法很好的分散，這也會導致背景異常升高。此時G50和G25無法純化這些形態的抗體，推薦使用更高分辨率的Superdex 200柱或其它替代品進行分離純化。

未經過優化的反應體系，

       也會引起的背景異常升高

偶聯有吖啶酯的抗體和包被有抗體的磁珠，在不同廠家自己的化學發光系統中進行免疫反應時，磁珠可能會發生異常聚集，該現象會導致檢測結果的異常。全自動檢測發光儀多數是全封閉系統，在反應杯中發生的磁珠聚集很難發現，所以很多研發人員會忽略這個情況，此時可能需要優化整個反應體系。其中，磁珠的種類，pH值和鹽濃度等都是可選的優化方向。

原輔料也會引起的背景異常升高

各個廠家開發的化學發光檢測系統，都會有一個正常背景信號值的基線或標準。如果在試劑的開發或檢測過程中，發現某些項目的背景信號值高出廠家設定的基線很多倍，在排除上述所有的可能性后依然沒有解決，也可以嘗試從原輔料搭配選擇適配性等方面尋找原因。表面活性劑、生物基質原料例如BSA、酪蛋白和動物血清等輔料的選擇、搭配以及批次差異均是需要加以考量的因素。

抗體適配性的問題

在試劑開發過程中，遇到部分性能異常或不及預期，研發人員通常優先想到的是抗體問題，所有的性能偏差都會歸因于抗體性能的問題。其實，抗體的適配性問題常常被研發人員忽視，不同的標記物標記相同抗體的表觀性能也會在部分項目中存在較大差異。德晟上文中提及的吖啶酯和堿性磷酸酶，是目前化學發光平臺最主要的標記物，兩者在在分子量和分子結構上也存在巨大的差異。作為小分子的吖啶酯與抗體偶聯后，偶聯物本身一般不會增加空間位阻。而市場上常用的重組堿性磷酸酶，分子量約為124KD，與抗體偶聯后會增加反應的空間位阻，兩種抗體偶聯物的檢測結果可能就會存在一定的差異。綜上，抗體的適配性是一個系統問題，需要我們綜合評估。