一些吖啶酯或者吖啶磺酰胺中都含有NHS基團，該基團不參與化學發光反應，但是它是吖啶酯能直接標記和交聯蛋白質、抗體或酶的關鍵基團，是可以與胺反應的交聯劑，在吖啶酯、熒光素以及其它生物分子探針中都應用普遍。

吖啶酯NHS酯標記蛋白

吖啶酯中NHS酯的結構

NHS酯指的是N-羥基琥珀酰亞胺（或N-羥基丁二酰亞胺）中的羥基脫去氫，與吖啶酯中羧基脫去羥基后的羰基相連而形成的特殊酯（-COO-N-）。這種酯可以與蛋白上的伯胺（一級氨基）反應，NHS酯中羰基相連的C-O鍵斷裂脫去NHS基團，然后羰基與蛋白氨基相連形成-CONH-酰胺鍵（即蛋白中羧氨脫水縮合形成的肽鍵），從而與蛋白質連接達到標記蛋白的目的。后續通過化學發光反應，以檢測被吖啶酯標記的蛋白。

NHS酯的優勢

與伯胺（-NH2）反應的化學基團有很多，也有一些吖啶酯以其它的方式來標記蛋白或者多肽，但是NHS酯更加通用和普遍。伯胺存在與每個多肽鏈或蛋白的N-端和賴氨酸（Lys，K）氨基酸殘基的側鏈中，即大多數蛋白都可被NHS酯標記。這些伯胺在生理 pH 下帶正電； 因此，它們主要發生在天然蛋白質三級結構的外表面上，很容易與引入水性介質中的結合試劑發生反應。此外，在典型的生物學或蛋白質樣品的化學官能基團中，伯胺尤為具有親核性，易與幾個反應性基團靶向結合，如NHS酯、異硫氰酸酯以及有些吖啶酯中用的碳二亞胺等。

吖啶酯NHS酯使用注意

NHS酯水解與伯胺反應產生競爭，水解速率隨pH增加而增加，所以低濃度蛋白記率會下降，所以吖啶酯標記蛋白時優先在生理至弱堿性環境pH（7.2-9）下完成。緩沖液可用磷酸鹽、碳酸鹽、HEPES或硼酸鹽緩沖液，含伯胺的Tris緩沖液會競爭而不相容，標記步驟結束可用Tris或甘氨酸緩沖液猝滅。德晟是化學發光試劑廠家，可提供含NHS及其它交聯結構的吖啶酯及相關緩沖劑。